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高通量测序在传染性病原菌检测和研究中所起的作用
发布时间:2017-05-22   浏览:322  

上海伯杰致力于病原体分子诊断领域,其中重要部分就是常见和新发病原体的深度测序(二代和三代)以及后续的数据分析。接下来两周我们将分别就细菌和病毒的深度测序所能提供的服务做一个简单的介绍。


细菌的二代测序的客户需求


在接触客户的过程中,我们感受到一些客户手里已经积累了大量的病原菌,也知道深度测序是一个检测或深入研究的利器。但是怎样将标本资源与二代测序技术有效组合,产生客户想要的结果,满足其需求并进一步构建后期可以一直使用的方法体系正是我们所提供的服务价值所在。这需要既懂病原微生物,又懂高通量测序技术和部分流行病学常识的客户经理与客户进行沟通交流。一般来说,客户需求可以分为以下几种:


需求一:对目标细菌进行分型(框架图)


有一些细菌通过常规血清凝集和/或现有PCR检测技术不能完全准确分型。这些病原菌在常规工作中出现的频率较高,经常导致聚集性的疫情或医院院感,有进一步的疾病防控意义和科研价值。很多时候客户查阅现有文献也无法构建准确的分型方法。那么就需要通过二代测序技术对细菌全基因组进行测序,获得这些细菌的基因序列图谱(这就是俗称的草图或者框架图)。在基因序列框架图的基础上,会给出相应的数据分析报告。包括:客户所收集的这批样品的基因相似度,与公共数据库中同类细菌的类似度,其基因差异区域,差异区域编码的蛋白种类,是否为该类细菌的关键蛋白和研究热点,差异基因是否有一定趋势,在不同菌株之间是否稳定,差异基因在近5年时间段内变异程度,是否具有一定地域性代表等等。在此分析基础上进而得到该差异基因是否可以被筛选作为Marker基因,用于该类细菌的基因分型。或者是几种差异基因的组合可以作为细菌分型的手段,进而在此基础上建立一些实验室更易于检测的分子生物学技术,比如PCR。这就实现了从应用到研究再到新应用的一个过程。


需求二:对目标细菌进行溯源(框架图)


很多食源性疾病中需要对致病菌进行溯源,寻找导致该疾病的源头,进而切断传染源。目前实验室常用脉冲场凝胶电泳(PFGE)进行上述操作。PFGE需要单独购买相应的仪器设备,有一定投入成本。另外该数据库开放程度不是很高,一线实验人员很难获得可以浏览库内所有数据的权限。可以利用二代测序技术,在获得了框架图之后,用电子酶切模拟PFGE图谱,既准确又省时。这个需求点结合需求一进行又事半功倍。


在一些重大事项的保障中,虽然二代测序获得一个菌株框架图的周期是一个月,无法很及时的给出导致聚集性疫情的细菌来源(比方说某个大型赛事或者事件应急保障中集体性食物中毒的来源究竟是食物、水还是某一病人)。但是因为其最终获得的是基因组序列,一旦后续确定该疫情来源于某一环节,可信度高,可作为金标准。这样提供给政策决策者的数据就具有信服力。一旦这种案例成功,相关部门在下次类似事件中处理中就更具有话语权,形成一个可靠的数据支撑有效的决策的品牌效应。


在一些医源性感染中,通过二代测序就可以明确确定是否是医源性感染,其感染源的来源。比方说医院感染常见的肺炎克雷伯、铜绿假单胞菌等细菌,搞清楚传染源,便于进一步施行控制措施。


需求三:对目标细菌中耐药和毒力改变的机制研究(完成图)


很多细菌携带3-4个质粒,多的可以达到7-8个。这些质粒决定着细菌的耐药和毒力情况。很多时候,同种细菌携带的质粒差异比较大。同属不同种的细菌带有的耐药和毒力基因差异反而小。质粒在不同的细菌之间传递,改变了一些细菌的生物学性状,让对该类细菌的研究变得更加复杂。因为质粒的基因组大小相差较大,小的几Kbp,大的几Mbp,所以在构建框架图中很难区分。这就需要对细菌基因组测序提出更高的要求,一般是要进行更精细的测序和分析,也就是所说的细菌的完成图。


细菌的完成图一般是通过二代(Miseq或者Hiseq)和三代测序(Pac-bio)一起进行。一般Miseq插入序列长度400bp,Hiseq为150bp,三代Pacbio可以达到20000bp.读长越长意味着数据拼接接口越少,准确度越高。上海伯杰对细菌的完成图根据测序片段长短又可以分为细菌完成图服务 (非多糖多酚,M < 7 Mb),细菌完成图服务 (多糖多酚,M < 7 Mb),细菌完成图服务(放线菌,7≤M<12Mb),细菌完成图服务(多糖多酚,7≤M<12Mb)和细菌完成图服务(非多糖多酚,非放线菌,7≤M<12Mb)五种。细菌完成图承诺染色体零 Gap,并免费赠送该菌中两个质粒的完成图。


细菌完成图是对目标菌的详细了解和研究,一般大的科研设计需要对数个目标菌先进行完成图了解其具体架构,在调整研究方案,结合框架图完成整体测序目标。


需求四:以目标细菌为主的微生态总体研究(完成图)


这个一般是进行科学研究为主,去年申请到的国自然课题中就有几个项目是针对某个部位的微生态研究。所谓的微生态是指样品中所有细菌,病毒,真菌,寄生虫的信息。一般微生态研究会回答三个问题1)有哪些微生物,有多少。2)环境中微生物的功能。3)不同微生物之间的关系。这就需要高通量测序及其后续的数据分析。1)有多少种类和数量的微生物?可以看到环境中所有微生物的组成以及他们的比例,因为传统的实验室分离培养只能得到常见的微生物,而99%的微生物无法得到体外纯培养物。测序富集到微生物(不考虑微生物是否仍然存活)后,直接提取基因组序列,不需要培养,因此可以得到更全的信息。2)微生物做什么?拿到所有微生物的基因组测序分析后,可以得到很多基因,通过对这些基因进行功能注释(GO 分析),能知道这些基因做什么,参与了哪些代谢反应,就能推测所有的微生物在做什么。虽然数据库中的基因已经达到了几百万个,但常见的基因功能分类就20多种而已,所以是可以实现的。3)不同微生物之间的关系:需要根据客户需求进行统计学分析,关注感兴趣的病原菌在整个微生态中所处的位置。阅读文献,建立微生态信息和疾病之间的关系。这是决定研究成果水平高低最关键的部分。这一部分也和需求三类似,需要获得细菌的完成图,在配合框架图进行。


伯杰提供细菌深度测序相关内容


一、分析流程


二、分析项目


分析项目EXCEL表格(用提供的Excel表格替换)。



三、基因组圈图绘制


首先将基因组序列,基因预测及非编码 RNA 的预测信息整合成标准的 GBK(GenBank)格式,然后采用 cgview 绘制该基因组的圈图(Stothard P 和 Wishart DS,2005),最后采用 Photoshop CS 对该图进行编辑,最后结果如下图所示。


圈图1


圈图2


圈图3



注:从内到外,第一圈代表刻度;第二圈代表 GC Skew;第三圈代表 GC 含量;第四圈和第七圈代表每一个 CDS 所属的 COG;第五圈和第六圈代表 CDS、tRNA 及 rRNA 在基因组上的位置。


具体服务内容,请电话咨询上海伯杰,电话:4008603688.


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