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流感病毒高效细胞分离培养试剂盒面市了 多快好省的做好流感病毒分离工作

发布日期:2018-08-22 浏览次数:21

为了更好的服务从事流感病毒培养工作的各位小主,上海伯杰近期推出了流感病毒高效细胞分离培养试剂盒。听名字就高大上,有木有?


一、试剂盒介绍

试剂盒包含以下组份:

品名 货号 备注
流感病毒高效细胞分离培养试剂盒(整套含一下5种) BJ-XB-001
MDCK-SUS细胞株1支 RC007 液氮保存,干冰运输,30天内可申请补发
M-SUS培养液1000ml CY41201 2-8摄氏度保存,可用于80-100支病毒培养
corning 250ml 锥形摇瓶10个 431144 室温保存
corning 50ml 透气培养管100支 431720 室温保存
Crystal 速度可调二氧化碳水平摇床 C0-06U 尺寸可以放入Thermo ESCO 170L 二氧化碳培养箱内

 

 

二、MDCK细胞用于培养流感病毒的历史介绍

没错,这是一款MDCK悬浮细胞。MDCK细胞用于流感病毒的分离已经有一段历史,最常被用于疫苗的生产。也有不少文献报道了MDCK细胞微载体贴壁悬浮培养或者单细胞培养进行疫苗的生产,但鲜有应用悬浮细胞进行临床标本中病毒分离。



我们这次推出的这款流感病毒高效细胞分离培养试剂盒使用的是MDCK-SUS细胞株,在国家流感中心下发的用于流感病毒培养的MDCK细胞基础上经过“驯化”变成的悬浮细胞。上海市黄浦疾控首先将悬浮培养的MDCK细胞应用于流感病毒分离培养,与传统贴壁MDCK细胞相比,悬浮的细胞提高了病毒吸附表面积,增加了吸附病毒的量。同时由于悬浮细胞的培养密度可以达到比较高的水平,在单位体积里也增加了病毒的产出,从而提高了流感病毒的血凝滴度。所以正是从简化常规工作流程提高工作效率入手,进行了这次科研创新,不禁为这些老师们点赞!


三、不同流感病毒培养效果展示

1.H1N1pdm09亚型或者乙型

根据标本Realtime

PCR的Ct值判断,推荐使用上海伯杰荧光PCR试剂盒。

Ct值≤25,一般接种24~48 h,HA即可达到128;

Ct值≥25,一般接种48~72 h,HA可达到16;

Ct值≥30,一般需要盲传一代,HA可达到16;

Ct值≥35,分离效果较差,建议弃用。

小贴士:H1N1pdm09或者乙型标本接种后的收获液经过-80摄氏度反复冻融(建议不超过三次),一般可以提升1到2个滴度。

2. H3N2亚型

建议选用Ct值不超过30的标本,一般接种原始标本后,72 h收获,继续抽取400 ul 样品盲传一代(继续培养72 h),HA可以达到8-32。

小贴士:H3N2亚型分离效果稍弱于H1N1pdm09亚型或者乙型,请注意选取Ct值偏低的标本。

不同培养天数的H3N2亚型流感病毒滴度。

四、与贴壁MDCK细胞比较数据


随机选取15个PCR检测阳性标本进行MDCK细胞的培养,平行选择MDCK贴壁细胞和该款流感病毒高效细胞分离培养试剂盒。接种一代之后的比较数据如下:

其中蓝色盖为贴壁MDCK细胞收获毒株,只有2个阳性。橘色盖为高效分离试剂盒分离结果,11个阳性。从这一数据可以看出,该试剂盒对H3N2亚型流感病毒分离培养有明显得提升效果。

将高效细胞分离培养试剂盒分出的标本盲传一代H3N2亚型滴度又有明显增加,数据如下:

可以看到进行接种的14个H3N2阳性标本全部(100%)在第二次传代之后种出病毒,滴度较第一代培养大大提高,其中10个滴度符合上送标本。

所以再遇到H3N2亚型流行季节,根本不用担心!


五、接种病毒时TPCK-胰酶耐受范围实验

传统贴壁MDCK细胞在接种流感病毒时使用的TPCK胰酶的浓度为:2mg/L.如果超出该浓度,细胞容易死亡。高效细胞分离培养试剂盒里面的MDCK-SUS细胞株可以耐受较宽广的TPCK-胰酶浓度范围:2-10mg/L。


六、试剂盒的优缺点总结

优点:

1.    

操作方便:细胞传代:只需要离心稀释或者直接稀释,不需要用胰酶进行消化;标本接种:不用洗涤细胞,也不存在病毒吸附的流程,直接加入标本进行培养,节省人力;病毒收获和鉴定:随时可以取出进行血凝试验,若滴度不满足,则可以继续培养,直到滴度满足上送需求。

2.    

滴度高:特别是H1N1pdm09亚型和乙型流感病毒,体现明显。即使是难以培养的H3N2亚型也有不错表现。具体见上面培养数据展示。

3.    

费用节省:一套试剂盒里面细胞和摇床一次购买基本不需要再请购,常用的就是培养液和耗材。培养液因为是无血清培养基,所以培养成本大大降低。

优点就是以下几个字:多 快 好 省

缺点:

1.    

为了能够使细胞悬浮生长并维持最好状态,需要配制摇床并使用专门无血清培养液。(整套试剂盒含有摇床,一次购买,永久使用)

2.    

为了得到更好的细胞生长和病毒分离效果,需要对传代和分离病毒前细胞进行计数和定量。


七、常见问题汇总(Q&A)

1. 可以观察细胞病变(CPE)吗?

可以的,将培养中的细胞吸出一部分放置在6孔或者24孔培养板的孔内,倒置显微镜下面观察。因为培养板有盖子,所以不用担心生物安全问题。

2. 为什么要使用专门的培养基?原来的可以用吗?

试剂盒里面搭配的培养基是专门针对这款MDCK-SUS细胞无血清培养基,该款培养基经过筛选,可以使该株细胞在培养扩增和接种病毒时效果最佳。已经有客户使用半年以上没有什么状况出现。不能使用原来的培养基,原来含有血清的培养基不支持细胞悬浮生长,会结成巨大的细胞团。

3. 病毒使用该款培养基培养会有基因变异吗?

即使在贴壁的MDCK细胞中流感病毒传3代以上也会有基因变异。所以国家流感中心目前都不再推荐传3代以上。本试剂盒的MDCK-SUS细胞和常规MDCK细胞相比,传3代以上没有基因改变。具体测序数据可以索取。

4. 收获后的病毒如何保存?

离心过滤掉细胞残渣可以4℃保存一周或者-70℃长期保存。

5. 分离和培养的转速有严格限制吗?

推荐按照试剂盒内SOP操作。转速太快,细胞损伤不容易吸附病毒,转速太慢细胞容易沉淀。

6. 培养周期有什么好的建议吗?

周一传,周五传,周一再传,3-4天传代。传代的时候就可以分出部分细胞,稀释到300-400万,直接加标本。一瓶细胞养了96小时,您可以一部分用来传代,另一部分稀释后,加胰酶和三抗,分装,然后直接加入标本,就可以培养病毒了。

7. 何时是接种最佳时期?

72~96小时都是对数生长期,都适合传代和接种。培养到72 ~96 h,细胞稀释后才可以用。最好72h 传代,96h遇到周末才这样。

8. 需要细胞计数吗?还是可以根据经验进行稀释?

前期操作建议进行细胞计数。后期根据经验可以省略,但是不建议。




七、常见问题汇总(Q&A)

1. 可以观察细胞病变(CPE)吗?

可以的,将培养中的细胞吸出一部分放置在6孔或者24孔培养板的孔内,倒置显微镜下面观察。因为培养板有盖子,所以不用担心生物安全问题。

2. 为什么要使用专门的培养基?原来的可以用吗?

试剂盒里面搭配的培养基是专门针对这款MDCK-SUS细胞无血清培养基,该款培养基经过筛选,可以使该株细胞在培养扩增和接种病毒时效果最佳。已经有客户使用半年以上没有什么状况出现。不能使用原来的培养基,原来含有血清的培养基不支持细胞悬浮生长,会结成巨大的细胞团。

3. 病毒使用该款培养基培养会有基因变异吗?

即使在贴壁的MDCK细胞中流感病毒传3代以上也会有基因变异。所以国家流感中心目前都不再推荐传3代以上。本试剂盒的MDCK-SUS细胞和常规MDCK细胞相比,传3代以上没有基因改变。具体测序数据可以索取。

4. 收获后的病毒如何保存?

离心过滤掉细胞残渣可以4℃保存一周或者-70℃长期保存。

5. 分离和培养的转速有严格限制吗?

推荐按照试剂盒内SOP操作。转速太快,细胞损伤不容易吸附病毒,转速太慢细胞容易沉淀。

6. 培养周期有什么好的建议吗?

周一传,周五传,周一再传,3-4天传代。传代的时候就可以分出部分细胞,稀释到300-400万,直接加标本。一瓶细胞养了96小时,您可以一部分用来传代,另一部分稀释后,加胰酶和三抗,分装,然后直接加入标本,就可以培养病毒了。

7. 何时是接种最佳时期?

72-96 H是细胞对数生长期,都适合传代培养和接种标本。培养到72 -96H,细胞稀释到适当浓度后才可使用。但传代培养最好是72H,遇到周末可适当延长时间。

8. 需要细胞计数吗?还是可以根据经验进行稀释?

前期操作建议进行细胞计数。后期根据经验可以省略,但是不建议。



七、常见问题汇总(Q&A)

1. 可以观察细胞病变(CPE)吗?

 可以的,将培养中的细胞吸出一部分放置在6孔或者24孔培养板的孔内,倒置显微镜下面观察。因为培养板有盖子,所以不用担心生物安全问题。

2. 为什么要使用专门的培养基?原来的可以用吗?

 试剂盒里面搭配的培养基是专门针对这款MDCK-SUS细胞无血清培养基,该款培养基经过筛选,可以使该株细胞在培养扩增和接种病毒时效果最佳。已经有客户使用半年以上没有什么状况出现。不能使用原来的培养基,原来含有血清的培养基不支持细胞悬浮生长,会结成巨大的细胞团。

3. 病毒使用该款培养基培养会有基因变异吗?

 即使在贴壁的MDCK细胞中流感病毒传3代以上也会有基因变异。所以国家流感中心目前都不再推荐传3代以上。本试剂盒的MDCK-SUS细胞和常规MDCK细胞相比,传3代以上没有基因改变。具体测序数据可以索取。

4. 收获后的病毒如何保存?

 离心过滤掉细胞残渣可以4℃保存一周或者-70℃长期保存。

5. 分离和培养的转速有严格限制吗?

 推荐按照试剂盒内SOP操作。转速太快,细胞损伤不容易吸附病毒,转速太慢细胞容易沉淀。

6. 培养周期有什么好的建议吗?

 周一传,周五传,周一再传,3-4天传代。传代的时候就可以分出部分细胞,稀释到300-400万,直接加标本。一瓶细胞养了96小时,您可以一部分用来传代,另一部分稀释后,加胰酶和三抗,分装,然后直接加入标本,就可以培养病毒了。

7. 何时是接种最佳时期?

 72-96 H是细胞对数生长期,都适合传代培养和接种标本。培养到72 -96H,细胞稀释到适当浓度后才可使用。但传代培养最好是72H,遇到周末可适当延长时间。

8. 需要细胞计数吗?还是可以根据经验进行稀释?

前期操作建议进行细胞计数。后期根据经验可以省略,但是不建议。